Влияние озонового воздействия на физиолого-биохимические процессы в проростках семян льна масличного

В последние десятилетия область применения озона значительно расширилась, имеются разработки но его эффективному использованию в медицине, сельскохозяйственном производстве, пищевой и перерабатывающей промышленности. В настоящее время ведутся работы но изучению механизмов действия озона на растительные объекты, которые открывают большие перспективы его применения в сельскохозяйственных целях.
Интенсификация растениеводства имеет важнейшее стратегическое значение для развития сельского хозяйства. В этой связи особый интерес представляет лён масличный, который является перспективной технической культурой. Семена льна масличного, являются источником высококачественного пищевого масла, используемого в медицинской практике, а так же как высококачественный пищевой продукт. Полученное из льняных семян масло по своей биологической ценности стоит на первом месте среди пищевых масел (Budvvig, 2000; Артюшкевич, 2008; Гордуновская, 2014; Неумывакин, 2014). В последние годы во всём мире возрос интерес к использованию семян льна и льняного масла в связи с их лечебными свойствами (Kritchevsky et al., 1995; Ayres, Loike, 2008; Перевалова, 2011;Шиндин, 2012).
Разработка методов, влияющих на увеличение иродуктивности и масличности семян льна, приобретает всё большее значение. Одним из направлений таких исследований может стать использование озона для обработки семян. Однако возникает много вопросов связанных с оптимальными параметрами обработки, физиологическим состоянием семян и ответной реакцией растительного организма па действие озона. При озоновом воздействии в растительном организме образуются активные формы кислорода, которые в результате своего окислительного повреждающего действия вызывают стресс. В связи с этим изучение стрессовых реакций, вызванных воздействием озона, является важным для выяснения функционирования антиоксидаптной защиты прорастающих семян. Исслслтование влияния различных доз озонового воздействия на физиологобиохимнческие показатели семян льна, его продуктивность и масличностъ, функционирование защитных антиоксидантных систем является актуальным.
Установлено, что озон обладает уникальными антибактериальными свойствами, экологической чистотой и безопасностью, экономичностью и простотой применения (Богдан, 2006; Chen et al., 2009), влияет па микрофлору и урожай растений. К пастояще.му времени имеются работы, в которых исследоватось влияние озона на урожайность и продуктипносп, сельскохозяйственных культур: пщеница, сахарная свёкла, горох, картофель, кохлятник, кукуруза (Купина, 1987; Резчиков и др., 1998; Pleijel et al., 2000; Tiedemann, Firsching, 2000; Danielsson et al, 2003; Шестерни, 2004; Васильчук, Эпштейн, 2007; Авдеева, 2008, Booker et al, 2009; Нормой, 2009; Данилов, 2010; Гаврилова, 2012; Сигачёва, 2014). В указанных работах в основном рассматриватась экологическая чисгота озона и его антибактериальные свойства, позволяющие подавлять патогенную микрофлору и тем самым способствовать сохранению урожая растений. Однако реакции растительного организма на действие озона, его морфофизиологические и биохимические показатели в них не рассматривались. Вместе с тем исследований по влиянию озонового воздействия на прорастание семян льна масличного и формирование урожая растений не проводилось.
Изучению стрессовых реакций и механизмов защиты растений от действия различных абиотических факторов посвящены многочисленные работы: Гуральчук Ж.З. (1994), Кургановой Л.Н. (1997), Asada К. (1997), Dat, J.F. et al. (2000), Веселова А.П. (2001), Шакировой Ф.М. (2001), MittIerR. (2002), Зыковой В.В и др. (2002), Чирковой Т.В. (2002), Полесской О.Г. (2007), Рощиной В.В. (2009). Авторами установлено, что в результате действия неблагоприятных абиотических факторов активируются процессы свободнорадикального окисления, приводящие к смещению нро-антиоксидантного равновесия, что может послужить запуском различных механизмов защиты взрослых растений. Также обнаружено, что при воздействии абиотических факторов, в растениях могут наблюдаться как подавляющие, так и стимулирующие процессы. Принимая это во внимание, представляет интерес изучение адаптационных возможностей прорастания семян льна после озонового воздействия.
Цель работы. Изучение влияния озона па морфофизиологические, биохимические показатели и продуктивность льна масличного, а также установление особенностей фупкциопирования защитных ответных реакций семян на действие озона.
Задачи исследовании:
1. Исследовать влияние озонового воздействия па морфофизиологические показатели прорастающих семян льна масличного, в зависимости от состояния семян перед озонированием.
2. Изучить влияние озона на биохимические показатели прорастающих семян.
3. Оценить зависимость величины озонового воздействия на активность свободнорадикальных процессов в проростках льна.
4. Изучить влияния озона на продуктивность и масличность семян льна.
5. Разработать интегратьное представление реакции проростка на озоновое воздействие и определить особенности функционирования его защитных систем.
Научная новизна работы.
Впервые проведены исследования реакции семян льна масличного па озоновое воздействие. Выявлены дозы озопа стимулирующие и подавляющие интенсивность прорастания семян льна в зависимости от физиологического состояния семян перед воздействием.
Впервые дана оценка изменений биохимических и свободнорадикальных процессов в проростках льна масличного, выращенных из сухих и увлажнённых перед воздействием озона семян.
Установлена доза озонового воздействия при предпосевной обработке семян льна, повыщающая продуктивность и масличность растений.
Разработана математическая модель, описывающая реакции проростка льна масличного на озоновое воздействие и определены механизмы функционирования защитных систем организма.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования позволяют расширить представление о биологической роли озона и механизмах функционирования защитных систем растительного организма.
Особенности реакции льна масличного на озоновое воздействие могут быть использованы для повышения посевных качеств семян, увеличения урожайности семян и выхода масла.
Полученные материалы диссертации приняты к использованию в учебном процессе ФГБОУ ВО Нижегородской ГСХА.
Методология и методы иселедования. Работа выполнена с использованием современных физиолого-биохнмических методов и оборудования. Подробно методология и методы исследования изложены в разделе «Материалы и методы исследования».
Положения, выносимые иа защиту:
1. Воздействие озоном приводит к изменению морфофизиологических и биохимических показателей прорастания семян льна масличного. Эффект стимуляции или подавления прорастания семян зависит от дозы озона и физиологического состояния семян.
2. При воздействии озоно.м на семена льна в его проростках происходит изменение активности свободнорадикальных процессов и, как следствие, смещение про-антиоксидантного равновесия.
3. При проведении полевых опытов у обработанных озоном семян льна изменяются их посевные качества, а также урожайность и биохимические показатели растений.
4. Математическая модель реакции проростка льна масличного на озоновое воздействие.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 62-й и 63-й студенческой научной конференции биологического факультета государственного университета им. Лобачевского: «Биосисте.мы: организация, поведение, управление» (П. Новгород, 2010), Международной научно-практической конференции, носвящениой 75-летия со дня рождения профессора Важенина А.П.: общетеоретические биологические и экономические вопросы сельского хозяйства (П. Новгород, 2013), 1 Всероссийской XII научной сессии молодых ученых и студентов с международным участием «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (П. Новгород, 2013), конференции «Research Journal of International Studies» XXVI (Екатеринбург, 2014), II международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и хозяйства: новые вызовы и решения» (Санкт-Петербург, 2014), 11 Всероссийской XIII Межрегиональной с международным участием научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (П. Новгород, 2015), международной научной конференции «Инновационные технологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2015), VI Международной научно-практической конференции «Научные исследования: от теории к практике» (Чебоксары, 2015).
Основные положения диссертации изложены в 16 научных работах, из них 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 220 наименований (173 отечественных и 47 иностранных). Диссертация содержит 141 страницу основного текста, 32 рисунка и 17 таблиц.
Соискателем проведён анализ состояния вопроса, обоснованы цели и задачи исследования, разработана программа и методика исследований, ca^юcтoятeльнo проведены опыты, наблюдения и лабораторные анализы, проведена статистическая обработка полученных данных. Обсуждены и описаны полученные результаты.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЛИЯНИИ ОЗОНА НА БИОСИСТЕМЫ
В главе 1 приведены сведения о влиянии озона на различные биологические системы и перспективы его применения в различных отраслях деятельности человека. Рассмотрены проблемы адаптации и устойчивости растений к абиотическим факторам окружающей среды. Описана роль активных форм кислорода и антиоксидантной системы растительного организма в условиях окислительного стресса.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования – семена льна обыкновенного, группа форм межеумочные (масличные), сорт пищевого назначения ЛМ-98 {Linum usitatissimum L var. intermedia Vav et EIL). Схема проведения экспериментально-аналитических работ приведена на рисунке 1. Рис.1 Схема проведения экспериментально-аналитических работ при исследовании влияния озона на растительный организм
Методика проведения опыта. Озон получали методом барьерного разряда из кислорода воздуха на малогабаритном генераторе озона. Концентрацию озона в озоно-воздушиой смеси (ОВС) определяли оптическим методом с помощью спектрофотометра СФ-26 при длине волны Х=254 нм. Семена перед началом опыта раскладывали на фильтровальную бумагу в чашки Петри по 50 шт. Воздействию озоном подвергались семена: 1) с>’хие; 2) увлажнённые; 3) смоченные и пророщенные в течение одного и двух дней.
В проведённых экспериментах концентрацию озона изменяли от 19 до 600 мг/м^, а продолжительность воздействия варьировалась от 0,25 до 40 мин (табл. 1). Под дозой (О) подразумевалось произведение концентрации (С) озона в ОВС, в которой содержался подопытный биообъект.
Озоновое воздействие производили однократно разными дозами в интервале от 5 до 24000 мг’мип/м^. Контрольные семена действию озона не подвергатись. После обработки семена проращивали в термостате в темноте при температуре 20- 22 °С по общепринятым методикам (ГОСТ 12038-84, 2011). Через 4 дня после закладки опыта у исследуемых проростков определяли морфофизиологические и биохимические показатели, активность свободнорадикальиых процессов, состояние антиоксидантной системы защиты. Определение энергии прорастания и лабораторной всхожести семян проводили по ГОСТ 12038-84; массовой доли влаги и сухого вещества по ГОСТЗ1640-2012; массовой доли сырого протеина по ГОСТ Р 51417-99 методом Къельдаля; сырого жира по ГОСТ 13496.15-97; растворимых углеводов по ГОСТ 26176-91; макроэлементов (калий по ГОСТ 30504-97 пламенно-фотометрическим методо.м, кальций по ГОСТ 26570-95 комплексонометрическим методом, фосфор по ГОСТ 26657-97 фотометрическим методом); каротина по ГОСТ 13496.17-95 фотометрическим методо.м.
Определение свободнорадикальной активности. Методо.м индуцированной хемилюмипесценции в проростках оценивали интегральные показатели свободнорадикальной активности: Uax – максимальную интенсивность свечения исследуемой пробы (мВ), характеризует свободпорадикальную активность образца; S – светосум.му, (мВхек) площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции, параметр обратно пропорционален антиоксидантной активности пробы, при анализе использовали показатель 1/S (отп.ед.). Показания регистрировали в течение 30 сек (Патент № 2284027, 2006).
Определение активности ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы проводили фотоколориметрическнм методом (Мелоды биохимического исследования…,1972), каталазы спектрофотометричсским методом (Patterson et al., 1984).
Методика проведения мелкоделпночного полевого опыта. Все повторения опыта размещали на одном опытном ушстке (S=25 м2 ), со сплошным расположением делянок площадью 1,0 м2 каждая (Доспехов, 2011). Обработанные озоном семена выдерживали один день перед посевом в темноте при температуре 20-22 °С. Норма посева 100 семян/м2. Определяли полевую всхожесть, ежедневно фиксировали высоту растений. Уборка урожая семян льна проводилась вручную. Биологическая повторность опыта двукратная (аналитическая – четырёхкратная).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использование.м программы Microsoft Excel. Достоверность различий определяли по критерию Стыодепта для уровня значимости р <0,05 (Доспехов, 2011).
ГЛАВА 3. ФИЗИОЛОГО-БПОХИ.МПЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПРОРОСТКОВ ПРИ ОЗОНОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА «СУХИЕ» СЕМЕНА
3.1. Морфофизнологическне показатели
При озоновом воздействии на сухие семена льна определяли лабораторную всхожесть, энергию прорастания па вторые и третьи сутки после начала проращивания (табл. 2). Установлено что, энергия прорастания контрольных семян на 2-ой день составила 35 %, при обработке семян ОВС максимальное значение показателя наблюдалось при дозе озона 190 мг*мин/м3 – 62 %, минимальное при /3=24000 мг*мин/м3 – 31 %. В отношении энергии прорастания на 3-ий день и лабораторной всхожести семян существенных изменений в данном диапазоне доз озонового воздействия достоверно зарегистрировано не было, что, по-видимому, связано с высокой средней скоростью процесса прорастания и с использованием семян последнего срока сбора, всхожесть которых близка к 100%. Результаты лабораторных опытов по влиянию озона на интенсивность ростовых процессов проростков льна представлены на рисунке 2. При воздействии большими дозами озона lg D>=3,78 (D>=6000 мг*мин/м3) происходит подавление ростовых процессов (кривая 1), нронент отклонения щтипы проростков достоверно ниже контрольного значения. При значении lg D <3,48 зарегистрирован стимулирующий эффект. Причём в интервале доз lg D=2,28-2,88 (D=190-750 мг*мин/м3), где наблюдалась наибольщая энергая прорастания второго дня, отмечены максимальные значения БЭ(1), достигающие 16,3-14,5 %.
В отношении массы опытных проростков наблюдается обратная зависимость. Процент отклонения массы проростка при дозах lg D=1,68-2,57 (D= 48-375 мг*мин/м3) достоверно ниже его контрольного значения (рис.2, кривая 2). Положительный БЭ(m) проростков наблюдается при дозах озона lg D>=2,88 (D>750 мг*мин/м3), с максимальным нревышением массы проростка над контролем при дозе lg D=3,18 (D = 1500 мг*мин/м3), где БЭ(m) составляет 8,5 %. Рис. 2. Зависимость БЭ длины (L) (1) и массы (т) (2) проростков льна от логарифма дозы озонового воздействия на сухие семена. Цифры курсивом обозначают дозы
Установлено, что проявляемый БЭ(L) проростков для каждой дозы озонового воздействия измеггяется в определенных пределах и зависит от выбора концентрации озона (С) и продолжительности воздействия (t). Поэтому с целью дифферепцировки влияния на полученный результат факторов С и t, вышеизложенные LЬ) проростков от концентрации озона (рис. За) и продолжительности воздействия на семена (рис. 36). На графиках имеются максимальные значения БЭ(L), регистрируемые, соответственно, при С=19-150 мг/м3 (рис. За) и t=2,5-10 минут (рис. 36), что в пересчете на дозы составляет 48-1500 мг*мин/м3. Таким образом, при обработке озоном сухих семян льна эффект стимуляции и подавления зависит от выбора С и t к примеру, для D=190 мг*мин/м3 максимальный БЭ(L) проростка наблюдается при следующих параметрах: С=19 мг/м3 и t=10 минут, а для D=6000 мг*мин/м3 при С=300 мг/м3 и t=20 минут.
3.2. Бнохимическне показатели
С целые выявления изменений биохимического состояния проростков льна проведён их общий биохимический анализ (табл. 3). Для анализа были выбраны образцы проростков выращенных из обработанных семян дозами озона: 190 мг*мин/м3 – соответствующая максимальному стимулирующему эффекту по длине и 6000 мг*мин/м3 – соответствующая началу подавления ростовых процессов от действия ОВС, а также из контрольных семян.
Массовая доля сухого вещества для проростков, выращенных из обработанных семян дозой озона 6000 мг*мин/м3 по сравнению с контролем осталась па прежнем уровне, что видимо, связано с внутренним перераспределением компонентов сухого вещества. При дозе озона 190 мг*мин/м3 наблюдается увеличение массовой доли сухого вещества на 5,2 %.
В исследуемых нроростках значения содержания каротииа и макроэлементов (калий и фосфор) относительно контроля не отличались. Но массовая доля кальция у всех обработанных образцов повысилась (табл.3).
Таблица 3. Биохимическая характеристика исследования проростков после озонового воздействия на сухие семена, % к абсолютно сухому веществу При воздействии на семена дозами озона 6000 и 190 мг*мин/м3 в образцах снижается содержание крахмала относительно контроля на 4,2 и 13,0 % соответственно, что, по-видимому, связано с повышением интенсивности его распада. При этом содержание иизкомолекулярпых Сахаров у опытных проростков, относительно контрольной группы повысилось для Д=6000 мг*мин/м3 на 8,3 %, для D=190 мг*мин/м3 на 12,0 %.
Озоновое воздействие оказывает небольшое угнетающее действие на белковый обмен, стимулирует липидпый обмен, что, по-видимо,му, увеличивает количество неполярных апилсодержащих липидов, являющихся основой масла.
3.3. Активность свободнорадикальных процессов в проростках льна в зависимости от величины озонового воздействия
Проведённые исследования были направлены на оценку активности свободиорадикальных процессов и состояние антиоксидантной системы защиты проростков в зависимости от дозы озонового воздействия.
Результаты исследований показали, что при обработке озоном D=6000 и 190 мг*мин/м3 в нроростках новышаются свободнорадикатьные процессы. Об этом свидетельствует достоверное повышение максимальной интенсивности хемилюминесценции опытных проростков (рис. 4). Рис. 4. Свободнорадикапьная активность проростков выращенны.х из сухих семян обработанных дозами 6000 и 190 мг*мин/м3
Повышение свободных радикалов в образцах свидетельствует об увеличении интенсивности ПОЛ (Кузьмина и др., 1983). Резкое возрастание процессов СРО, сопровождающееся активированием ПОЛ характеризует скорость выхода семян из состояния покоя (Рогожин и др., 1999). Таким образом, полученные результаты позволяют рассматривать процессы СРО не только как факторы запуска защитных механизмов при озоновом воздействии, но и как необходимым посредником в процессах активации пусковых механизмов прорастания семян.
Исследование антиоксидантной системы защиты. Оценивали по общей антиоксидантной активности (ОАА) и активности ферментов каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы.
При озоновом воздействии на сухие семена в проростках льна, по сравнению с контролем, наблюдается достоверное снижение ОАА (рис. 5). Наибольшее снижение отмечено для дозы 190 мг*мин/м3 на 30,8 %. В проростках льна, выращенных из сухих обработанных семян на 4 день, активность ферментов по сравнению с контролем значительно снижалась: по пероксидазе (для D=190 в 2,21 раза, для D=бООО в 1,52 раза) и полифенолоксидазе (для D=190 в 1,28 раза, для D=6000 в 2,64 раза) (рис. 6). Можно предположить, что снижение связано с угнетением синтеза белка (табл. 4) и усилением окислительного стресса (рис. 4). В случае с каталазой при озонировании семян дозами D=190 и 6000 мг*мин/м3 активность фермента в проростках по сравнению с контролем повышалась на 42,5 и 79,9 % соответственно (рис. 6). Видимо, в условиях повышенного содержания свободных радикалов компоненты антиоксидантной защиты функционируют в комплексе, взаимосвязано, и снижение активности одного из них компенсируется повышением других.
Однако причины изменения активности ферментов при стрессовом воздействии, еще не достаточно ясны. Согласно литературным данным изменение активности ферментов при стрессе может быть связано с изменением компонентного состава (Половникова, 2010; Виноградова, 2012).
3.4. Оценка продуктивности льна при предпосевном озоновом воздействии
Влияние предпосевного озонового воздействия на рост и развитие льна масличного в период вегетации. Для того чтобы выяснить как предпосевное озоновое воздействие на семена повлияет на их прорастание, развитие в период вегетации и формирование урожая в условиях окружающей среды в 2013-2014 гг проводили мелкоделяночные полевые опыты. Выбраны дозы озона: 190 мг*мин/.м3 – (образец D=190) и 6000 мг*мин/м3 – (образец D=6000).
В ходе полевых испытаний отмечено, что самая высокая полевая всхожесть наблюдалась у образцов D=190 – 68±3 %, наименьшая у образцов D=6000 – 45±5 % (контроль – 60±3 %).
Полученные результаты по средней высоте стояния растений, за период от появ/гения всходов до начала цветения, представлены в виде значений биологического эффекта (рис.7). Полученные данные показали, что на начальных стадиях роста всходы льна D=6000 существенно отстают в развитии относительно контроля, а у всходов D=190 отмечается положительный БЭ(l). Рис. 7. Зависимости БЭ высоты растений, выращенных из семян, обработанных дозой озона 190 и 6000 мг*мин/м3
К дате 1 июля (25 дней от посева) у обработанных образцов относительно контроля наблюдали выраженные пики: для D=190 – 13,6 %, для D=6000 – 8,2 %. Через несколько дней пики плавно опускаются до определенного уровня, с сохранением стабильной тенденции превышающей контроль, для D=190 в среднем на 9 %, для D=6000 на 3%.
Влияние предпосевного озонового воздействия на урожай и иасличность семян льна. После наступления фазы цветения, измерения длин растений прекращали. Дальнейшие исследования продолжались в период созревания семян, путем сбора их урожая (табл. 4). Самый высокий урожай получен у образцов D=190 – 506 г/м2 , за счёт повышенной всхожести и большего количества коробочек на растении, чуть ниже – 403 г/м2 у контроля, самый низкий – 271 г/м2 у D=6000, связан с низкой полевой всхожестью (45 %) и меньшим содержанием коробочек (табл. 4). Получили, что для дозы D=190 мг*мин/м3 урожайность семян повышается на 25,6 %. Биохимический анализ урожая показал, что у семян собранных с образцов растений D=190 относительно контроля наблюдается снижение содержания Сахаров на 44,4 % и крахмала на 11,2 %. У семян D=6000 повышение Сахаров в 2 раза и снижение содержания крахмала на 3,4 %. Содержание протеина в опытных образцах относительно контроля достоверно не отличалось. Содержание каротина у семян D=190 снижается до 3 мг/кг, а у семян D=6000 повышается до 5 мг/кг. У семян D=190 наблюдается повышение масличности на 2,3 %, а для семян D=6000 снижение на 1,8 % (рис. 8). Как видно из полученных результатов изменение метаболической активности опытных проростков, вызванное озоновым воздействием, на стадиях прорастания отразилось в дальнейшем на полевой всхожести, характере развития растений, урожайности семян и их биохимическом составе.
ГЛАВА 4. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПРОРОСТКОВ ПРИ ОЗОНОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА «ВЛАЖНЫЕ» СЕМЕНА
4.1. Морфофизиологические показатели
В связи с условием, что озон хорошо растворим в водной фазе (Лунин и др., 1998), дальнейшее направление нашего исследования связанное с изучением влияния воды в процессах озонового воздействия на семена льна. Рис. 9. Зависимости БЭ(L) (1) и массы БЭ(m) (2) проростков от lgD, выращенных из семян, увлажнённых перед озоновым воздействием
При обработке озоном увлажнённых семян происходит подавление ростовых процессов, выраженных в длине проростков во всём диапазоне доз (рис.9, кривая 1).
Аналогичная зависимость наблюдается и в отношении биологического эффекта, связанного с массой проростков с единственным исключением, что пиковая зона находиться в области положительных значений при дозе озона lg D=2,88 D=750 мг*мин/м3) и составляет 6,6 % (кривая 2).
Таким образом, фактор смачиваемости семян перед озоновым воздействием существенно повлиял на получаемый в настоящих экспериментах результат.
Влияние озона на длину и массу проростков, выращенных из семян, замачиваемых в воде одни и двое суток до воздействия. С целью выявления причин изменения локализации пика зависимостей БЭ(L) и БЭ(m) от дозы озонового воздействия проведены опыты с семенами льна, находившихся в смоченном состоянии до воздействия 1 и 2 суток (рис. 10 и 11). При обработке семян замоченных на 1 сутки в отношении БЭ(L) и БЭ(m) наблюдаются подавляющие процессы. Небольшой стимулирующий эффект по длине и массе проростков наблюдается только в диапазоне малых доз lg D=1,21- 1.38 (D=19-24 мг*мин/м3) (рис. 10).
При обработке семенного материата замоченного на 2 суток видно (рис. 11), что при малых дозах озона lg D=0,70-1,00 (D = 5-10 мг*мин/м3) в отношении БЭ(L) и БЭ(m) наблюдаются пики, находящиеся в области положительных значений для БЭ(L) 5,0 – 8,6 % (кривая 1), для БЭ(m) 8,1-10,5 % (кривая 2). При дозах озона lg D>1,38 (D>24 мг*мин/м3) отмечен отрицательный эффект.
Проявляемые закономерности биологических эффектов пронессов прорастания при озоновом воздействии. Для выявления закономерностей, наблюдаемых при обработке семян, находившихся в смоченном состоянии до воздействия ОВС разное время, сопоставили полученные результаты биологического эффекта по длине проростков (рис. 12).
У кривых 2, 3, 4 наблюдается смещение пиков вдоль оси lgD к началу координат. Причём величина этого смещения зависела от продолжительности смачивания семян до обработки: чем продолжительнее смачивание, тем ближе расположен пик к началу координат. Таким образом, выявляется закономерность: чем дольше семя льна находилось в смоченном состоянии перед обработкой, тем меньше доза озонового воздействия необходима для получения стимулирующего эффекта (сравните: 10, 24 и 1500 мг*мин/м3; (lgD=1,00, lgD=1,38, lgD=3,18)) и тем выше будет этот стимулирующий эффект (сравните: 8,6; 4,7 и -1,5%). Проведённый анализ указывает на экспоненциальный характер зависимости величины стимулирзтощего эффекта от логарифма дозы озонового воздействия, что соответствует развитию многих биологохимических процессов (Чурмасов и др., 2002). Рис. 12. Зависимости БЭ(L) от lgD проростков льна, выращенных при воздействии озоном на семена: сухие (1), увлажнённые (2), замоченные на одни (3) и двое (4) суток перед обработкой. Пунктирные отрезют на каждой кривой указывают ширину пиков и экспоненциальную кривую, соединяющую вершины
Следует отметить закономерность, связанную с шириной выявленных в исследованиях вышеуказанных пиков (рис.12), то есть интервалов lgD, на высоте меньшей максимального значения каждого пика на величину БЭ(L) = 6 %. Например, ширина пика, полученного в опытах с сухими семенами, составляет lgD=1,5, с семенами смоченными перед обработкой – lgD=\,2, смоченными за 1 сутки до обработки – lgD =0,7 и смоченными за 2 суток до обработки – lgD=0,5. Причём эти различия нельзя объяснить случайными вариациями значений lgD. Следовательно, чем больше продоляштелыюсть смачивания семян льна до момента обработки, тем более узкий интервал озонового воздействия необходим для наблюдения эффекта стимуляции. Вероятно, эта закономерность отражает факт усложнения структуры прорастающего семени и появления возможньк специализированных систем для адекватного реагирования на повреждающее окислительное воздействие.
4.2. Биохимические показатели
С целью выявления значимости фактора смачивания семян перед обработкой проведён общий биохимический анализ опытных проростков льна (табл. 5). В анализ включены проростки, выращенные при обработке влажных семян дозой озона 190 мг*мин/м3, и исключены проростки, выращенные из семян с продолжительным смачиванием (1 и 2 суток), так как за это время их первоначальное состояние .могло измениться.
Массовая доля сухого вещества для проростков, выращенных при обработке увлажнённых семян D=190 м*мин/м3, по сравнению с контролем и проростками выращенных из сухих обработанных семян увеличилась.
Биохимический анализ не позволил обнаружить существенных изменений в содержании каротина, катия и фосфора. Массовая доля кальция у опытных проростков относительно контроля повысилась.
В опытных проростках наблюдается снижение крахмала и протеина, а также повышение содержания Сахаров и жира по сравнению с контролем и опытами на сухих семенах.
Таблица 5. Биохимическая характеристика исс.тедования проростков после озонового воздействия на увлажнённые семена, % к абсолютно сухому веществу Зарегистрированная динамика биохимических показателей свидетельствует о возрастании интенсивности обменных процессов у опытных групп проростков.
4.3. Активность свободнорадикальных процессов в проростках льна, выращенных нз влажных обработанных озоном семян
Активность свободнорадикальных процессов. Для проростков, полученных из смоченных перед обработкой семян, при D=190 мг*мин/м3 отмечено снижение значения максимальной интенсивности хемилюминесценции по сравнению с контролем до 0,634 мВ, а D=6000 мг*мин/м3 – повышение показателя до 0,798 мВ (рис.13). Величина рассогласования в значениях 1„ии: для опытов с сухими и влажными семенами для D=190 мг*мин/м3 составила 0,317 мВ, а это снижение на 33,3 % по сравнению с опытами на сухих семенах. Можно предположить, что снижение процессов свободнорадикааьного окисления ниже нормальных величин является неблагоприятным фактором, так как в проростках, выращенных из обработанных влажных семян D=190 мг*мин/м3, резко снижаются ростовые процессы, нарушается клеточный метаболизм.
Проведена оценка максимальной интенсивности хемилюминесценции для проростков с максимальным значением БЭ(L), выращенных из семян, находившихся в смоченном состоянии перед обработкой различное время (рис. 14). Корреляционный анализ показал, что с увеличением продолжительности смачивания семян перед обработкой значения максимального БЭ(L) проростков возрастают прямо пропорционально Lmax (r=0,81).
Исследование антиоксидантной системы защиты. При обработки увлажнённых семян в исследуемых проростках льна для D=190 мг*мин/м3 наблюдается повышение ОАА по сравнению с контролем до 0,204 отн.ед, для D=6000 мг*мин/м3 – снижение до 0,172 отн.ед (рис.15). Отметим, что с добавлением к семенам воды перед обработкой ОАА проростков относительно опытов с сухими семенами для D=190 мг*мин/м3 повышается на 51,1%.
Проведён анализ ОАА для проростков с максимальным значением БЭ(L), выращенных из семян, находившихся в смоченном состоянии перед обработкой различное время (рис. 16). Корреляционный анализ показал, что с увеличением продолжительности смачивания значения максимального БЭ(L) проростков возрастают обратно пропорционально OAA, (r=-0,98).
У проростков, выращенных из увлажнённых семян обработанных дозами озона 6000 и 190 м*мин/м3, активность фермента пероксидазы статистически не отличалась от контроля, а активность фермента каталазы но сравнению с контролем повышалась на 47,8 и 63,4 % соответственно (рис. 17).
В проростках льна, выращенных из семян, находившихся в смоченном состоянии до воздействия 1 и 2 суток, обработанных дозами озона, которые соответствовали максимальному биологическому эффекту по длине проростков для каждого отдельного состояния (соответственно для замоченных на 1 день – 24 мг*мин/м3, на 2 дня – 10 мг*мин/м3), активность фермента пероксидазы снижалась на 44,9 и 13,6 % соответственно (рис. 18). В проростках, выращенных из увлажнённых семян обработанных дозой озона D=1500 мг*мин/м3, которая соответствовала максимальному биологическому эффекту по длине проростков, активность пероксидазы статистически не отличалась от контроля (рис. 18). Рис. 17. Активность фермента каталазы и пероксидазы в проростках льна, выращенных из увлажнённых семян обработанных дозами озона 6000 и 190 мг*мин/м3 Таким образом, фактор смачиваемости семян льна перед их обработкой существенно повлиял на изменение активности свободнорадикальных процессов и состояние антиоксидантной системы защиты проростков. Можно предположить, что при обработке семян, предварительно замоченных на 1 и 2 суток, повышение свободнорадикальной активности и снижение ОДА связано с уменьшением надежности и усложнением структуры организма в момент начала прорастания.
ГЛАВА 5. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ РЕАКЦИИ ПРОРОСТКА ЛЬНА НА ОЗОНОВОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
Озон является важным фактором, влияющим на многие стороны роста и развития растений. Механизмы же его влияния на эти процессы во многом остаются неясными. В исследованиях (Чурмасов и др. 2002) ранее было проведено математическое моделирование реакции растений на озоновое воздействие, позволившее определить некоторые его аспекты, связанные с обработкой семян облепихи, козлятника, ячменя. Результаты наших экспериментов следует учесть при модернизации этих представлений.
Основные положения модели. Представляет интерес теоретически получить зависимости БЭ(L) от lgD основываясь на ранее разработанных модельных представлениях (Чурмасов и др., 2002). Будем исходить из того, что реакция биосистемы на озоновое воздействие определяется тем количеством молекул реагента, которое проникло в организм. Это количество, однозначно зависит от величины дозы озонового воздействия (Чурмасов и др., 2002). Озон, являясь сильным окислителем, вызывает повреждения различных структур живой системы и подавляет процессы жизнедеятельности (рис. 19). Это подавление может быть двояким: с одной стороны оно приводит к ухудшению функционирования различных механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность, с другой – в зависимости от степени и вида повреждений – полностью выключать эти механизмы из обменных процессов. Таким образом, снижение жизнеспособности в результате воздействия озоном является плавно-ступенчатой функцией, опосредованным, общей активной физиологической реакцией организма. Активность физиологической реакции проявляется в существовании специальных адаптированных к повреждающему фактору защитных систем организма. Озон – глобальный фактор, действующий на всех этапах эволюционного развития биосферы. Поэтому закономерным является образование адекватных антиоксидантных систем, адаптированных к этому фактору (Рубин, 1987). Эти защитные системы включаются при достаточно низком уровне озоновых разрушений, а способ их нейтрализации связан с усилением синтетической активности организма по восстановлению его разрушенных структур. Вероятно, подобные защитные механиз.мы существуют не только в отношении озонового воздействия, но и других возможных повреждающих факторов. По-видимому, учитывая общую целесообразность организации живой материи, эти механизмы дополняют друг друга в общей реакции организма на неблагоприятные воздействия окружающей среды. Очевидно, вначале включаются адекватные защитные механизмы, адаптированные к определенным повреждающим факторам, затем при увеличении их интенсивности подключаются и другие, уже неадекватные защитные механизмы. Таким образом, повышается шанс выживания биосистемы во всём диапазоне интенсивности разрушающих воздействий.
С течением времени в процессе прорастания происходит усложнение организма в соответствии с программой развёртывания наследственной генетической информации. Однако усложнение системы всегда приводит к уменьшению её надежности. Поэтому следует ожидать усиления разрушающего озонового воздействия во всём его диапазоне и в отношении всех возможных видов разрушений. Однако следует учесть и неизбежность усложнения защитных систем организма, а, следовательно, и увеличение эффективности их нейтрализующих действий. Исследование динамики реакции проростка на озоновое воздействие представляется актуальной как в научном, так и в практическом отношении.
Формализация модели. При построении модели в качестве показателя жизнеспособности организма (Р) используем процентное отклонение значения параметра изучаемой биосистемы после озонового воздействия от величины того же параметра в норме, то есть до воздействия.
Таблица 6. Общая характеристика слагаемых входящих в модель (4) Для проверки адекватности модели сопоставляли её следствия с экспериментальными данными, полученными на проростках льна масличного, выращенных из сухих и влажных семян, а также после озонового воздействия на одно- и двухсуточные проростки. В пределах погрешности измерений удалось приблизить все теоретические значения к экспериментальным (рис.20) при определённых наборах (табл. 7) постоянных уравнения (4) для каждой кривой. Совпадение теоретических значений Ро с экспериментапьными свидетельствует о правильности основных положений модели.
Для объяснения формы полученных экспериментальных кривых, на графиках выделили моменты, при каких дозах происходит включение и выключение различных механизмов реакций (рис. 20). Математическая модель позволяет расширить представление о роли озона в процессе воздействия, заключающаяся в разрушении различных биоструктур организма. Особенности и динамики этих разрушений определяются состоянием и возрастом проростка при обработки, а также величиной дозы озонового воздействия. Включение специализированных ангиоксидаитных систем организма происходит при определённых дозах озонового воздействия, зависящих от состояния и возраста проростков.
ВЫВОДЫ
1. При обработке озоном сухих семян льна в интервале доз 90-750 мг*мин/м3 выявлен стимулирующий эффект в отношении интенсивности прорастания семян льна масличного. Причём при дозе 190 мг*мин/м3 с параметрами озонирования: С=19 мг/м3 и t=10 минут, отмечен максимальный биологический эффект длины проростка. Обработка дозами озона 6000 мг*мин/м3 и выше подавляет ростовые процессы. При озонировании гидратированных семян ростовые процессы подавляются
2. Стимулирующая доза озона 190 мг*мин/м3 оказывает гармоничное влияние на углеводный и белковый о^мен.веществ в тканях проростков семян: содержание Сахаров в сухих семенах относительно контроля увеличилось на 12%, на фоне снижения крахмала и белка на 13 и 3,5 % соответственно. В проростках гидратированных семян перед воздействием эти процессы выражены в большей степени – уровень сахароз увеличивался на 26,9 %, содержание крахмала и протеина снизилось на 20,1 % и 6,6 % соответственно.
3. Под действием озонового воздействия в проростках происходит увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов и снижение общей антиоксидантной активности, исключение составили проростки, выращенные из увлажнённых семян обработанных дозой 190 мг*мин/м3, для которых наблюдается обратная зависимость. Установлено, что под действием озона в проростках активность ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы снижалась, активность каталазы увеличивалась, причём степень этих изменений зависит от физиологического состояния семян и параметров воздействия.
4. Предпосевное озонирование семян льна дозой озона D=190 мг*мин/м3 повышает полевую всхожесть на 13,3 %, улучшает показатели роста растений увеличивает урожайность семян на 25,6 % и содержание в них масла на 2,3 %.
5. Разработана математическая модель реакции проростков льна масличного на озоновое воздействие, которая позволяет прогнозировать характер ответной реакции растительного организма на озоновое воздействие, определяющая ввд и характер получаемых организмом повреждений, а также состав и порядок действия его защитных систем. Позволяет выявить параметры функционирования защитных систем организма по результатам экспериментальных данных.